HyClone胎牛血清培養平滑肌細胞的兩種方法

 　　HyClone胎牛血清培養血管平滑肌細胞常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzyme disperse)。下麵一起來看下這兩種方法。

　　1、貼塊法

　　方法：動物經頸動脈放血後，在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段，置於(yu) 含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗幹淨後剝除外膜的纖維脂肪層，然後縱行切開血管，刮除內(nei) 膜即內(nei) 皮細胞迅速撕下中膜內(nei) 、中層，切成約1mm寬的小條，浸泡在含血清的Hank's液中，並將撕下小組織塊種植於(yu) 培養(yang) 瓶壁。置於(yu) 37℃恒溫箱，2h左右，取出培養(yang) 瓶加入20% HyClone胎牛血清的培養(yang) 液，再放回培養(yang) 箱內(nei) 靜止培養(yang) 4天。4天後可見細胞從(cong) 組織中遷移遊出。

　　不同動物血管結構有差異，豬和猴較易操作，但小動物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特點，使之難以分離。另外組織塊太薄，不易粘附培養(yang) 基，也使細胞較難生長。為(wei) 了保證培養(yang) 的成功，應注意：

　　①種植組織塊的數目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少於(yu) 30;

　　②根據培養(yang) 細胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，應加胎牛血清(FBS)，通常濃度為(wei) 10%～20%;

　　③培養(yang) 基的選擇：常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium)，M199培養(yang) 基。培養(yang) 兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。

　　2、酶解離法

　　沿動脈縱軸切開後，刮除內(nei) 皮細胞撕下中膜的內(nei) 2/3，注意不要混入內(nei) 皮細胞，將組織塊切成1-2mm2，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yang) 基中，37℃，0.5～1.5h。離心去上清，重複上述消化步驟，然後再離心(9000r,4min)，收集細胞，在5%～10%同種血清或HyClone胎牛血清的M199培養(yang) 基中調整細胞數，然後轉入30～90mm培養(yang) 皿中培養(yang) ，對於(yu) 兔子應加入高濃度的穀氨酰胺(0.2g/L)較佳。不同研究者在培養(yang) 基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異。

　　綜上所述，貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高，量多，操作簡便的優(you) 點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質內(nei) 肌絲(si) 喪(sang) 失，亞(ya) 細胞器增加。相反，酶解離法，由於(yu) 酶的作用使細胞間失去連接，細胞內(nei) 肌絲(si) 含量豐(feng) 富，保持收縮型狀態。培養(yang) 平滑肌細胞常取材於(yu) 兔、豬、鼠、猴的胸腹主動脈段。由於(yu) 貼塊法和解離法處理方式不同，在細胞培養(yang) 的zui初階段細胞形態和性質存在差異。隨著培養(yang) 時間的延長，培養(yang) 環境趨於(yu) 一致，細胞特性上也趨於(yu) 近似。