脂質體2000轉染DNA的操作過程

 　　脂質體2000適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下zui方便的轉染方法之一。轉染率高，優於磷酸鈣法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

　　用脂質體(ti) 2000進行轉染時，首先需優(you) 化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：先要固定一個(ge) DNA的量和DNA/LR混合物與(yu) 細胞相互作用的時間，DNA可從(cong) 1~5μg和孵育時間6小時開始，按這兩(liang) 個(ge) 參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩(liang) 者*的劑量，確定出轉染時間(2~24小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為(wei) 宜。

　　細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為(wei) 受體(ti) 細胞。

　　快速脂質體(ti) 轉染法操作步驟如下：

　　(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yang) 皿)培養(yang) 24小時，使其達到50~60%板底麵積。

　　(2)在試管中配製DNA/脂質體(ti) 複合物方法如下：

　　①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體(ti) DNA。

　　②旋轉1秒鍾，再加入脂質體(ti) 懸液，旋轉。

　　③室溫下放置5~10分鍾，使DNA結合在脂質體(ti) 上。

　　(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次後棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體(ti) 複合物，37℃培養(yang) 3~5小時。

　　(4)再於(yu) 每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養(yang) 14~24小時，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂質體(ti) 混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yang) 24~48小時。

　　(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

　　穩定的脂質體(ti) 轉染方法如下：

　　(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底麵積可用於(yu) 轉染。

　　(2)DNA/脂質體(ti) 複合物製備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yang) 48小時。

　　(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yang) 液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。

　　注：脂質體(ti) ，即lipofectin regeant，LR