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瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。電泳後區帶易染色，樣品極易洗脫，便於(yu) 定量測定。製成幹膜可長期保存。
瓊脂糖凝膠電泳也常用於(yu) 分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限製性內(nei) 切核酸酶圖譜製作等。由於(yu) 這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為(wei) 基因工程研究中常用實驗方法之一。本文主要給大家說說，瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理及方法。
一、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理
瓊脂糖凝膠電泳是用於(yu) 分離、鑒定和提純DNA片段的標準方法。瓊脂糖是從(cong) 瓊脂中提取的一種多糖，具親(qin) 水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下(pH8.0的緩衝(chong) 液)帶負電荷，在電場中通過凝膠介質向正極移動，不同DNA分子片段由於(yu) 分子和構型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡合物，經紫外線照射後，可分出不同的區帶，達到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。
二、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的方法
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們(men) 的相對分子量質量及分子構型，同時與(yu) 凝膠的濃度也有密切關(guan) 係。
(1)核酸分子大小與(yu) 瓊脂糖濃度的關(guan) 係
① DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與(yu) 堿基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與(yu) 未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們(men) 分開。此時電泳的遷移率不再依賴於(yu) 分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
② 瓊脂脂糖的濃度。不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
(2)核酸構型與(yu) 瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guan) 係
不同構型DNA的移動速度次序為(wei) ：供價(jia) 閉環DNA(covalently closed circular，cccDNA)>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA(一般為(wei) 球形)不能進入膠中，相對遷移率為(wei) 0(Rm=0)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0)，由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決(jue) 於(yu) 凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩衝(chong) 液離子強度等的影響。
三、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的實驗步驟
1、安裝電泳槽
將有機玻璃的電泳凝膠床洗淨，晾幹，用膠帶將兩(liang) 端的開口封好，放在水平的工作台上，插上樣品梳。
2、瓊脂糖凝膠的製備
稱取瓊脂糖溶解在電泳緩衝(chong) 液中，(按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠)置微波爐或沸水浴中加熱至*溶化(不要加熱至沸騰)，取出搖勻。
3、灌膠
將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4、待瓊脂糖膠凝固後，在電泳槽內(nei) 加入電泳緩衝(chong) 液，然後拔出梳子。
5、加樣
將DNA樣品與(yu) 加樣緩衝(chong) 液按4：1混勻後，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl，記錄樣品的點樣次序和加樣量。
6、電泳
安裝好電極導線，點樣孔一端接負極，另一端接正極，打開電源，調電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時，停止電泳。
7、染色和觀察
取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為(wei) DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時要小心，必須戴手套。
四、實驗器具及藥品
電泳儀(yi) ，電泳槽，紫外透射反射儀(yi) ，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍，溴化乙錠。
當前位置：