脂質體2000轉染法的詳細操作步驟分享

　　1、操作步驟[方法一]：

　　(1)脂質體(ti) 2000的轉染準備：用2mL不含血清培養(yang) 液漂洗兩(liang) 次，再加入1mL不含血清培養(yang) 液。

　　(2)細胞培養(yang) ：取6孔培養(yang) 板(或用35mm培養(yang) 皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105個(ge) 細胞培養(yang) 液，37℃CO2培養(yang) 至40%~60%匯合時(匯合過分，轉染後不利篩選細胞)。

　　(3) 轉染液製備：在聚苯乙稀管中製備以下兩(liang) 液(為(wei) 轉染每一個(ge) 孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養(yang) 基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yang) 基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鍾，稍後會(hui) 出現微濁現象，但並不妨礙轉染(如出現沉澱可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。

　　(4)轉染：把A/B複合物緩緩加入培養(yang) 液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yang) 液繼續培養(yang) 。

　　(5)其餘(yu) 處理如觀察、篩選、檢測等與(yu) 其它轉染法相同。

　　注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

　　2、快速脂質體(ti) 2000轉染法操作步驟如下[方法二]：

　　(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yang) 皿)培養(yang) 24小時，使其達到50~60%板底麵積。

　　(2)在試管中配製DNA/脂質體(ti) 2000複合物方法如下：

　　①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體(ti) DNA。

　　②旋轉1秒鍾，再加入脂質體(ti) 2000懸液，旋轉。

　　③室溫下放置5~10分鍾，使DNA結合在脂質體(ti) 2000上。

　　(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次後棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體(ti) 複合物，37℃培養(yang) 3~5小時。

　　(4)再於(yu) 每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養(yang) 14~24小時，

　　(5)吸出DMEM/DNA/脂質體(ti) 混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yang) 24~48小時。

　　(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

　　3、穩定的脂質體(ti) 轉染方法如下：

　　(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底麵積可用於(yu) 轉染。

　　(2)DNA/脂質體(ti) 複合物製備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。

　　(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yang) 48小時。

　　(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yang) 液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。